【Thorlabs教程】激光掃描顯微鏡

介紹

激光掃描顯微鏡(以下簡稱LSM)，特別是共聚焦LSM和多光子LSM，能夠對厚塊樣品進行逐層成像。在共聚焦LSM中，焦平面之外的樣品產生的光信號會被光闌阻擋而無法探測；多光子LSM在焦平面以外不會產生任何可探測信號。如下圖所示，綠色表示產生的信號。

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對比機制

生物樣品的對比度比較低，在LSM中一般使用熒光來提高對比度。熒光分子首先吸收一定能量的光從基態躍遷到激發態，然后在返回基態時發出熒光。熒光強度與入射激光強度成正比。由于自然損耗，熒光光子能量低于入射光子，即波長更長。如下圖A所示。

多光子激發在兩個或更多光子同時到達并且能量總和滿足躍遷能量時才會發生。熒光光子能量將高于入射光子，即波長更短。如下圖B所示。

多光子還有使用非吸收過程的對比度機制，如諧波和合頻。在允許諧波產生的條件下，多個入射光子將同時湮滅并產生一個新的光子，其能量是之前所有光子的能量總和，如下圖C所示。

LSM產生信號原理，其中A和B為吸收過程，C為非吸收過程

多光子顯微鏡的非線性特性意味著要求高光子密度才能觀察諧波產生。為了滿足這個條件，且保持較低的平均功率，一般使用鎖模飛秒激光器，特別是鈦藍寶石激光器。

圖像形成

在點掃描LSM中，點光源在樣品上成一個衍射極限光斑，然后又成像到單點探測器上，一般使用光電倍增管，但某些情況也可以是雪崩光電二極管。單點掃描和單點探測技術的一個明顯優勢在于，可以根據特定的實驗要求設置顯示圖像分辨率、光學分辨率和掃描場。

在共聚焦LSM中，平行光通過掃描系統和物鏡后在樣品上形成一個衍射極限光斑。被激發的熒光信號在二向色鏡與激發光分離并聚焦。針孔就位于該焦點位置，焦平面之外的熒光信號會被針孔阻擋，從而形成光學切面。

多光子LSM在焦平面之外幾乎不會產生熒光信號，不需像共聚焦LSM一樣使用針孔選擇熒光，因此光路更簡單，探測器可以盡可能靠近物鏡，最大化信號收集效率。